Im Jahr 1384 legte Graf Johann I. von Wertheim den Grundstein für die spätgotische Basilika.
Die dreischiffige evangelische Stiftskirche St. Marien stammt aus dem 14. Jahrhundert und steht vermutlich auf den Fundamenten zweier romanischer Vorgängerbauten. Mit dem Bau des Chores wurde 1388 begonnen, 1481 folgte die Erhebung der Pfarrkirche zur Stiftskirche. Im Obergeschoss des spätgotischen Baus wurde eine Bibliothek eingerichtet, für die der Gelehrte Konrad Wellin als Grundstock 1448 rund 63 Bücher stiftete. Heute umfasst die Sammlung etwa 900 mittelalterliche Handschriften und frühe Drucke, worunter sich auch eine der drei noch existierenden sogenannten „Wertheimer Bibeln" befindet. Im Erdgeschoss des Chores finden sich die Grabmäler des Wertheimer Grafengeschlechts. Im Zuge der Reformation wurde die Stiftskirche schrittweise ab 1522 zum evangelischen Gotteshaus.
Rund 100 Jahre später spaltete sich die Grafenfamilie in einen protestantischen und einen rekatholisierten Zweig auf – die Stiftskirche wurde von nun an als Simultankirche genutzt: Im Chor wurden katholische Messen gehalten, während im Langhaus evangelische Gottesdienste gefeiert wurden. Diese Simultan-Nutzung der Kirche dauerte bis zur Vollendung der katholischen Pfarrkirche St. Venantius im Jahr 1842. Als Besonderheit weist die Stiftskirche einen leicht asymmetrischen Grundriss auf, der zum einen dem damaligen Straßenverlauf und zum anderen eventuellen Planungsfehlern geschuldet ist.
Neben dem Eingang der Wertheimer Stiftskirche führt eine gewundene Sandsteintreppe zu einem kleinen Seitenraum im Turm: die Heilig Geist Kapelle. Über dem Eingang dieser Kapelle hängt die Wertheimer Madonna aus dem frühen 14. Jahrhundert. An ihr zeigt sich der Wandel des majestätischen mittelalterlichen Marienbildes zur liebenden Mutter.
In unmittelbarer Nähe des Eingangs befindet sich eine E-Bike-Ladesäule zur kostenfreien Nutzung.
